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什么是 FLIM 熒光壽命成像?

簡(jiǎn)介：

文章要點(diǎn):

1.熒光壽命成像（FLIM）技術(shù)用于測(cè)量整個(gè)樣品熒光壽命的變化。

2.使用脈沖激光器和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）來(lái)記錄FLIM圖像。

3.熒光壽命成像（FLIM）提供了傳統(tǒng)熒光強(qiáng)度成像無(wú)法獲得的額外信息。

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熒光壽命的概念為什么使用FLIM FLIM采集和分析相關(guān)產(chǎn)品

熒光壽命的概念

熒光壽命是指熒光分子在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間，這個(gè)時(shí)間可以反映熒光分子的內(nèi)在屬性和所處的微環(huán)境，與局部熒光團(tuán)濃度和激發(fā)強(qiáng)度無(wú)關(guān)。熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging ，FLIM)）是一種重要的熒光顯微鏡技術(shù)，通常用于研究生物分子間相互作用、細(xì)胞中的信號(hào)事件或區(qū)分光譜重疊的熒光團(tuán)。此外，F(xiàn)LIM 可以提供有關(guān)電信號(hào)變化、離子和氧含量、溫度、細(xì)胞或其環(huán)境中的 pH 值的定量信息。FLIM技術(shù)因具有非常高的靈敏度和分子特異性而廣泛的應(yīng)用生物學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域。

圖 Perrin-Jablonski能級(jí)示意圖所示，熒光是分子吸收能量后，基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后從第一單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的，而熒光壽命是指分子在單線激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間。分子中處于單線態(tài)的基態(tài)電子能級(jí)S0上的電子，根據(jù)Frank-Condon規(guī)則吸收某一波長(zhǎng)的光子后，被激發(fā)到單線態(tài)的激發(fā)態(tài)電子能級(jí)S1中的某一個(gè)振動(dòng)能級(jí)上，這個(gè)過(guò)程的時(shí)間約為10^-15 s；經(jīng)過(guò)短暫的振動(dòng)馳豫過(guò)程后（時(shí)間約10^-12~10^-10 s），S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上會(huì)積累大量的電子。這一狀態(tài)的電子釋放能量回到基態(tài)S0能級(jí)。

FLIM的黃金標(biāo)準(zhǔn)是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）。TCSPC利用快速秒表測(cè)量激發(fā)脈沖與探測(cè)熒光之間的時(shí)間差。使用高重復(fù)脈沖激發(fā)光激發(fā)樣品，在每一個(gè)脈沖周期內(nèi)，最多激發(fā)熒光分子發(fā)出一個(gè)光子，然后記錄光子出現(xiàn)的時(shí)刻，并在該時(shí)刻記錄一個(gè)光子，再下一個(gè)脈沖周期內(nèi)也是相同的情況，經(jīng)過(guò)多次計(jì)數(shù)可以得到熒光光子隨時(shí)間的分布曲線。

為什么使用FLIM

熒光壽命成像（FLIM）是一種成像技術(shù)，樣品熒光壽命的變化在圖像中產(chǎn)生對(duì)比度（圖1）。FLIM廣泛用于生物醫(yī)學(xué)成像，其中組織和細(xì)胞用一種或多種熒光染料染色。染料的熒光壽命取決于局部微環(huán)境，F(xiàn)LIM比其他成像技術(shù)（如寬場(chǎng)成像）提供了額外的維度，如環(huán)境信息。FLIM也越來(lái)越多地用于研究光致發(fā)光材料，例如對(duì)納米材料、太陽(yáng)能電池和半導(dǎo)體的載流子壽命變化進(jìn)行成像。

圖1 使用RMS1000共聚焦顯微拉曼光譜儀測(cè)量（a）小鼠腸道切片和（b）小鼠腎臟切片的FLIM圖像。

FLIM采集和分析

FLIM采集

熒光衰減是使用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）獲得的。在TCSPC中，用脈沖激光激發(fā)樣品，并測(cè)量激光脈沖和檢測(cè)到的熒光光子之間的時(shí)間（圖2a）。該過(guò)程重復(fù)數(shù)百萬(wàn)次，以創(chuàng)建熒光光子計(jì)數(shù)與到達(dá)時(shí)間的直方圖（圖2b）。

將樣品上感興趣的區(qū)域劃分為像素，并使用TCSPC記錄每個(gè)像素的熒光衰減（圖2c）。通過(guò)移動(dòng)樣品臺(tái)（樣品臺(tái)掃描）或激光點(diǎn)（激光掃描）將激光點(diǎn)引導(dǎo)到每個(gè)像素上。這個(gè)過(guò)程按順序發(fā)生，依次記錄每個(gè)像素的熒光衰減，以構(gòu)建直方圖數(shù)據(jù)合集。

圖2 （a）使用TCSPC記錄單個(gè)光子到達(dá)時(shí)間；（b）單個(gè)像素的熒光衰減直方圖；（c）感興趣區(qū)域內(nèi)逐個(gè)記錄像素的熒光衰減直方圖。

FLIM分析

計(jì)算每個(gè)像素?zé)晒馑p直方圖的熒光壽命。通常用最小二乘法將單指數(shù)模型擬合到每個(gè)衰減來(lái)計(jì)算，以獲得熒光壽命τ（圖3）。將通過(guò)擬合獲得的熒光壽命對(duì)應(yīng)到顏色圖上，構(gòu)建顏色編碼的熒光壽命圖像。

圖3 計(jì)算FLIM數(shù)據(jù)，每個(gè)像素的熒光壽命對(duì)應(yīng)顏色變化，構(gòu)建顏色編碼的熒光壽命圖像。

相關(guān)產(chǎn)品

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